Caracterización de dos sistemas de expresión en levadura (Saccharomyces cerevisiae) mediante fusiones transcripcionales con el gen reportero lacZ

Abstract

En este trabajo se caracterizó y comparó la regulación transcripcional de dos sistemas de expresión para levaduras: el CUP1 que es inducidle y de expresión moderada y el PMA1 que es constitutivo y de expresión fuerte. Para lograr esto, se construyeron las fusiones transcripcionales CUP1::lacZ y PMA1::lacZ en los vectores monocopia pSAL5 y pRS5, que fueron introducidos en la levadura W303-1A que luego se sometió a diferentes tratamientos para registrar el comportamiento de ambos promotores mediante ensayos de p-galactosidasa. Se corroboró que el promotor CUP1 es titulable por cobre y su máxima expresión se logró al adicionar 200 pM de CuS04 y la inducción se detectó desde los 15 minutos. En experimentos de inducción a una y dos horas, CUP::lacZ redujo la expresión en medio con galactosa y glicerol, comparado con el medio con glucosa. Al mantener a los cultivos por todo el ciclo de crecimiento, el resultado fue a la inversa, ya que la mayor expresión se obtuvo en glicerol, luego en galactosa y en glucosa ocurrió una represión parcial. Diversos estreses en general redujeron la expresión del gen reportero a las dos horas de aplicado el tratamiento,pero el efecto fue más drástico en medio con LiCI o con H202. Al crecer por todo el ciclo a la levadura con o sin NaCI , se observó un efecto de represión sobre la expresión del gen que se acentuó al transcurrir el ciclo de crecimiento. En la fusión PMA1::lacZ, al aplicar como fuente de carbono a glucosa, galactosa o glicerol, en cultivos en fase exponencial creciendo en glucosa, no se observó un descenso en la expresión. En experimentos con las mismas fuentes de carbono por todo ei ciclo de cultivo, se obtuvo mayor expresión en glicerol, luego en galactosa y finalmente en glucosa, lo cual no concuerda con reportes de la literatura. Al aplicar diferentes tipos de estrés como choque térmico, frío, estrés osmótico y oxidativo, el efecto fue muy leve hasta las dos horas