Regeneración por organogénesis directa y transformación genética de frijol (Phaseolus vulgaris L.) Mediante bombardeo de micropartículas

Abstract

La transformación genética de frijol requiere de un protocolo de cultivo de tejidos para regenerar plantas completas, así como de un método eficiente de transferencia de genes. Esta especie ha sido considerada recalcitrante a ambos métodos, por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron: establecer un protocolo de regeneración in vitro eficiente para diferentes variedades de frijol por medio de organogénesis directa y un método de transformación genética mediante bombardeo de micropartículas para frijol. Respecto al primer objetivo, a partir de cinco variedades comerciales sembradas por cuatro semanas en medio con 10 μM benzilaminopurina (BAP) se eligieron a ʹFlor de mayoʹ (FM-199) y ʹRojo rayadoʹ (RR) con base en la inducción de brotes múltiples, cuyo porcentaje fue de 78 y 84 % (explantes con brotes), respectivamente. Además, respecto al número de brotes por explante la mejor fue ʹBayomexʹ (BAY) con 3.2; BAY tuvo respuestas adecuadas con 0.6 y 1.0 mg·litro-1 de BAP (el callo es casi nulo y los primordios de raíz presentes). La regeneración de plantas por organogénesis directa con ejes embrionales fue promovida en medios de cultivo con sales inorgánicas MS 100 %, vitaminas Gamborg B5 (MSB5) y diferentes concentraciones de 6- benzilaminopurina (BAP) y de tidiazurón (TDZ), en BAY y FM el TDZ indujo 2.9 y 2.5, y BAP 1.8 y 2.2 brotes por explante, respectivamente. La longitud de los nudos de la parte apical se redujo significativamente cuando aumentó la concentración de ambas citocininas. En la zona del hipocotilo, la raíz se indujo con concentraciones de TDZ entre 0.41 y 1.73 µM, y entre 0.44 y 1.68 µM de BAP; y el callo se indujo entre 2.72 y 4.54 µM de TDZ y entre 2.66 y 4.44 µM de BAP. Cuando los brotes obtenidos en MSB5 con 2.72 y 4.54 µM de TDZ en FM fueron cultivados posteriormente en medio MSB5 con 2.72 µM de TDZ, éste promovió el desarrollo y la regeneración de plantas; en BAY los brotes obtenidos en medios con TDZ cultivados posteriormente en MSB5 con 0.44 µM de BAP produjeron 4.4 brotes por explante. La formación de raíz en los brotes se promovió en medio MSB5 con 0.44 µM de BAP o en medio con ausencia de reguladores (MS0). Plantas aclimatadas en suelo, produjeron flores y semillas. Los ejes embrionarios cultivados en medio MSB5 con 10 µM de BAP tuvieron la mayor apertura meristemática entre 48 y 72 h; posteriormente, fueron bombardeados con micropartículas cubiertas con DNA plasmídico (p35SGUSINT). La expresión transitoria (ET) del gen reportero GUS fue evaluada y se obtuvo 87.5 % de los explantes con ET a 900 psi, 6 cm de distancia del blanco y un disparo; por cada explante en promedio se presentaron 6.97 unidades de expresión transitoria (UET) por epicótilo, 63.7 por hipocótilo y sólo 0.38 en el meristemo, lo que mostró una eficiencia muy baja. La regeneración se presentó con un promedio de 68.2%. Plantas completas (R0) fueron transferidas al invernadero para su aclimatación. Las semillas fueron germinadas “in vitro” y desarrolladas a plantas completas (R1/T0), la ET del gen GUS fue evaluada en hoja y peciolo, la respuesta positiva fue 73.3 %. Finalmente, mediante PCR con un inserto del gen nptII, indicó que de 19 plantas adultas sólo cuatro presentaron amplificación del fragmento correspondiente, lo que demostró un bajo porcentaje de transformantes.