Regeneración por organogénesis directa y transformación genética de frijol (Phaseolus vulgaris L.) Mediante bombardeo de micropartículas
Regeneración por organogénesis directa y transformación genética de frijol (Phaseolus vulgaris L.) Mediante bombardeo de micropartículas
Date
2014-04
Authors
Martínez Castillo, Benjamín
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Universidad Autónoma Chapingo
Abstract
La transformación genética de frijol
requiere de un protocolo de cultivo de
tejidos para regenerar plantas
completas, así como de un método
eficiente de transferencia de genes.
Esta especie ha sido considerada
recalcitrante a ambos métodos, por lo
tanto, los objetivos de este estudio
fueron: establecer un protocolo de
regeneración in vitro eficiente para
diferentes variedades de frijol por
medio de organogénesis directa y un
método de transformación genética
mediante bombardeo de
micropartículas para frijol. Respecto al
primer objetivo, a partir de cinco variedades comerciales sembradas
por cuatro semanas en medio con 10
μM benzilaminopurina (BAP) se
eligieron a ʹFlor de mayoʹ (FM-199) y
ʹRojo rayadoʹ (RR) con base en la
inducción de brotes múltiples, cuyo
porcentaje fue de 78 y 84 %
(explantes con brotes),
respectivamente. Además, respecto al
número de brotes por explante la
mejor fue ʹBayomexʹ (BAY) con 3.2;
BAY tuvo respuestas adecuadas con
0.6 y 1.0 mg·litro-1
de BAP (el callo es
casi nulo y los primordios de raíz
presentes). La regeneración de
plantas por organogénesis directa con
ejes embrionales fue promovida en
medios de cultivo con sales
inorgánicas MS 100 %, vitaminas
Gamborg B5 (MSB5) y diferentes
concentraciones de 6-
benzilaminopurina (BAP) y de
tidiazurón (TDZ), en BAY y FM el TDZ indujo 2.9 y 2.5, y BAP 1.8 y 2.2
brotes por explante, respectivamente.
La longitud de los nudos de la parte
apical se redujo significativamente
cuando aumentó la concentración de
ambas citocininas. En la zona del
hipocotilo, la raíz se indujo con
concentraciones de TDZ entre 0.41 y
1.73 µM, y entre 0.44 y 1.68 µM de
BAP; y el callo se indujo entre 2.72 y
4.54 µM de TDZ y entre 2.66 y 4.44
µM de BAP. Cuando los brotes
obtenidos en MSB5 con 2.72 y 4.54
µM de TDZ en FM fueron cultivados
posteriormente en medio MSB5 con
2.72 µM de TDZ, éste promovió el
desarrollo y la regeneración de
plantas; en BAY los brotes obtenidos
en medios con TDZ cultivados
posteriormente en MSB5 con 0.44 µM
de BAP produjeron 4.4 brotes por
explante. La formación de raíz en los
brotes se promovió en medio MSB5
con 0.44 µM de BAP o en medio con ausencia de reguladores (MS0).
Plantas aclimatadas en suelo,
produjeron flores y semillas. Los ejes
embrionarios cultivados en medio
MSB5 con 10 µM de BAP tuvieron la
mayor apertura meristemática entre
48 y 72 h; posteriormente, fueron
bombardeados con micropartículas
cubiertas con DNA plasmídico
(p35SGUSINT). La expresión
transitoria (ET) del gen reportero GUS
fue evaluada y se obtuvo 87.5 % de
los explantes con ET a 900 psi, 6 cm
de distancia del blanco y un disparo;
por cada explante en promedio se
presentaron 6.97 unidades de
expresión transitoria (UET) por
epicótilo, 63.7 por hipocótilo y sólo
0.38 en el meristemo, lo que mostró
una eficiencia muy baja. La
regeneración se presentó con un
promedio de 68.2%. Plantas
completas (R0) fueron transferidas al invernadero para su aclimatación.
Las semillas fueron germinadas “in
vitro” y desarrolladas a plantas
completas (R1/T0), la ET del gen
GUS fue evaluada en hoja y peciolo,
la respuesta positiva fue 73.3 %.
Finalmente, mediante PCR con un
inserto del gen nptII, indicó que de 19
plantas adultas sólo cuatro
presentaron amplificación del
fragmento correspondiente, lo que
demostró un bajo porcentaje de
transformantes.
Description
Tesis (Doctorado en Ciencias en Horticultura)